pdf35

Ribogospod. nauka Ukr., 2017; 4(42): 65-74
DOI: https://doi.org/10.15407/fsu2017.04.065 
УДК 606:62:639.3:639.212

Розроблення мультиплексної ПЛР для генетичного аналізу популяцій веслоноса (Polyodon spathula Walbaum, 1792)

Х. М. Курта, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. , Українська лабораторія якості і безпеки продукції АПК, смт Чабани
О. О. Малишева, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. , Інститут ветеринарної медицини НААН України, м. Київ
В. Г. Спиридонов, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. , Інститут ветеринарної медицини НААН України, м. Київ

Мета. Розробити та відпрацювати мультиплексну—ПЛР мікросателітної ДНК веслоноса (Polyodon spathula) для проведення популяційно-генетичного моніторингу його стад, культивованих в умовах рибницьких господарств України.

Методика. Для проведення досліджень використовували мультиплекс ПЛР для чотирьох мікросателітних ДНК-маркерів: Psp12, Psp21, Psp26 та Psp28. Оцінку результатів ефективності розробленої мультиплексної ПЛР та опрацювання отриманих даних проводили шляхом фрагментного аналізу ДНК на генетичному аналізаторі “ABI Prism 3130” (Applied Biosystem, США).

Результати. За результатами поділу продуктів мультиплексної ПЛР методом капілярного електрофорезу було встановлено, що розміри ампліфікованих фрагментів для кожного з чотирьох досліджуваних локусів Psp12, Psp21, Psp26 та Psp28 в одній ПЛР відповідали очікуваним. Аналіз даних електрофореграми показав, що за локусом Psp21 спостерігалася найвища інтенсивність піку, яка була на рівні 611 флуоресцентних одиниць (ФО), а найнижча інтенсивність піку спостерігалася для локусу Psp26 і була на рівні 105 ФО. У мультиплексній ПЛР після відповідної інтерпретації отриманих даних нами було ідентифіковано алельні варіанти в гетерозиготному стані для локусів Psp12 (218/220 п.н.), Psp26 (144/146 п.н.) та Psp28 (256/258 п.н.). При цьому, локус Psp21 (150/150 п.н.) ідентифіковано в гомозиготному стані.

Наукова новизна. Проведено оптимізацію та розроблено методику мультиплексної ПЛР для генотипування веслоноса за мікросателітними ДНК-маркерами.

Практична значимість. Отримані результати досліджень можуть бути застосовані для генотипування веслоноса при виконанні програм з селекційно-племінної справи та штучного відтворення даного виду риб.

Ключові слова: веслоніс, мікросателіти, ДНК-маркери, мультиплекс, ПЛР, генотипування, генетичний аналіз.

ЛІТЕРАТУРА

  1. Курта Х. М., Малишева О. О., Спиридонов В. Г. Сучасний стан та перспективи досліджень генетичної структури веслоноса (Polyodon spathula) // Наукові доповіді Національного університету біоресурсів і природокористування України. 2016. № 6 (63). URL: http://journals.nubip.edu.ua/index.php/Dopovidi/issue/view/308 (21.10.2016).
  2. Третяк О. М., Грициняк І. І., Тарасюк С. І. Використання ДНК-маркерів у дослідженнях генетичної структури племінного матеріалу веслоноса (Polyodon spathula (Walb.)) // Рибогосподарська наука України. 2012. № 4. C. 117—120.
  3. Jennings C. A., Zigler S. J. Ecology and biology of Paddlefish in North America: historical perspectives, management approaches, and research priorities // Reviews in Fish Biology and Fisheries. 2000. Vol. 10. P. 167—181. https://doi.org/10.1023/A:1016633604301 
  4. Status, trends, and management of sturgeon and paddlefish fisheries: correction / Pikitch E. K. et al.// Fish and Fisheries. 2006. Vol. 7. P. 78—79.
  5. Mims S. Aquaculture of Paddlefish in the United States Aquat // Living Resour. 2001. Vol. 14. P. 391—398. https://doi.org/10.1016/S0990-7440(01)01137-8 
  6. Genetic structure among four populations of paddlefish, Polyodon spathula (Actinopterygii: Acipenseriformes: Polyodontidae), based on disomic microsatellite markers / Zheng X. et al. // Acta Ichthyol. Piscat. 2014. Vol. 44(3). P. 213—219. https://doi.org/10.3750/AIP2014.44.3.05 
  7. Nuclear Markers of Danube Sturgeons Hybridization / Duda A. et al. // Molecular Sciences. 2011. № 12. Р. 6796—6809. https://doi.org/10.3390/ijms12106796 
  8. Малишева О. О., Спиридонов В. Г., Мельничук С. Д. Впровадження генетичної паспортизації осетрових в Україні // Тваринництво України. 2015. № 9. С. 12—15.
  9. Microsatellite markers for the paddlefish (Polyodon spathula) / Heist E. J. et al. // Conservation Genetics. 2002. Vol. 3. P. 205—207.
  10. Нeist E. J., Mustapha A. Genetic Structure in Paddlefish Inferred from DNA Microsatellite Loci // Transactions of the American Fisheries Society. 2008. Vol. 137, iss. 3. Р. 909—915. https://doi.org/10.1023/A:1015272414957 
  11. Polymorphism of microsatellite loci – a tool in studying biodiversity of paddlefish aquaculture broodstock / Kaczmarczyk D. et al // Environmental Biotechnology. 2007. Vol. 3. P. 44—48.
  12. Спиридонов В. Г. Розробка  методики  ДНК-ідентифікації  осетрових 
    видів  риб  з  використанням  полімеразної ланцюгової  реакції  в  реальному  часі // Рибогосподарська наука України. 2017. № 2 (40). С. 68—77.
  13. Microsatellite multiplex assay for the analysis of Atlantic sturgeon / Panagiotopoulou H. et al. // Appl. Genet. 2014. Vol. 55, iss. 4. P. 505—510. https://doi.org/10.1007/s13353-014-0216-y 
  14. Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology / Elnifro E. M. et al. // Clin. Microbiol. Rev. 2000. № 13(4). P. 559—570. https://doi.org/10.1128/CMR.13.4.559-570.2000 
  15. Edwards M., Gibbs R. Multiplex PCR: advantages, development and applications // PCR Methods and Applications. 1994. Vol. 3. P. 65—75. https://doi.org/10.1101/gr.3.4.S65 
  16. Визначення достовірності походження коней української верхової породи та мікросателітний аналіз ДНК / Спиридонов В. Г. та ін. // Біологія тварин. 2009. Т. 11, № 1–2. С. 265—269.
  17. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / Boom R. et al. // Journal of Сlinical Microbiology. 1990. Vol. 28. P. 495—503.
  18. Carter M. J., Milton I. D. An inexpensive and simple method for DNA purifications on silica particles // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21. P. 1044—1046. https://doi.org/10.1093/nar/21.4.1044 
  19. Курта Х. М. Малишева О. О., Спиридонов В. Г. Оптимізація умов полімеразної ланцюгової реакції для дослідження мікросателітної ДНК веслоноса (Polyodon spathula) // Біологія тварин. 2017. Т. 19, № 2. С. 56—63.
  20. DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis : User guide. [S. l.] : Thermo Fisher Scientific Inc., 2014. PN 4474504. P. 219.
  21. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations / Marshall T. C. et al. // Molecular ecology. 1998. P. 639—655. https://doi.org/10.1046/j.1365-294x.1998.00374.x 
Головна2017№ 4/2017 (42)2017-04_065-074_Kurt